有谁能告诉我Sephadex LH20的用法？（包括层析柱的处理、样品的处理、洗脱剂的采纳及使用、层析中的防卫事项等）。谢谢！Sephadex LH20使全心得谈：1 Sephadex LH20是一种价格较高的填料，使用请千万防卫，很贵的哟！（天然，雇主有钱就另当别论拉）2 先讲Sephadex LH20 的道理。 Sephadex LH20的分离道理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分派的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，是以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，临了出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分派的作用，是以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。3 再讲Sephadex LH20 洗脱溶剂。听我讲完 第2点后，其实就应该明晰Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增多甲醇比例，临了用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增多甲醇比例，临了用100％甲醇冲柱。4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的采纳。如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）融解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！如若把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很肉痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇融解，过滤后，湿法上样。5 分离的时间，临了说说我的使全心得 （1） 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。 （2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增多将极地面改善分离，所不要抠门填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓连合上风军力，打击敌东谈主。 （3） 馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。 （4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。 （5）鞣质因素死吸附严重，如不在乎填料者露出 同人，可用Sephadex LH20 分鞣质 （6）Sephadex LH20 对黄酮类因素的分离成果极佳露出 同人，门径很成型，有大齐文件参考。 （7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用终于写完啦，此手册乃多年体味之心得，望用好。未尽事项日‘后探讨。率先超过感谢你的匡助！再次体会到了的缓和。象这样的好同道，给加几许分齐不为过，猛烈提出加分！本东谈主还有一个问题：我一共买了100g Sephadex Lh20（花了1700元，果然好贵），待分离的样品为水溶性的，极性很大，据报谈有用因素可能为多肽或环肽类物资。我如果径直将粗提物上Sephadex柱层析，可行不？如果100g Sephadex概况一次可分离几许样品？多谢！你是雇主依然学生？它是很贵的，我可以洽商一下请问yxssmaster，在不同的溶剂中的吸涨进度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响.还有是不是样品的融解是不是要与洗脱的起使浓度沟通?怎样笃定样品在最好配比的容液中溶呢?还有分到什么进度是用Sephadex LH20比较好?不好道理，过了这样久才回话解答如下:1 "在不同的溶剂中的吸涨进度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响." 天然有影响，Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨进度是不同的(任何填料齐是这样，仅仅Sephadex LH20很显豁)，一般在丙酮，乙酸乙酯 中松懈很横暴，是以一般无谓丙酮，乙酸乙酯 作溶剂，如果前后使用的两种洗脱溶剂对Sephadex LH20的吸涨进度收支很大，还会产生大齐气泡.以下列举了1g干态的，Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积： water 2.1ml MeOH 1.9ml EtOH 1.8ml CHCl3 1.6ml n-BuOH 1.6ml 丙酮 0.8ml 乙酸乙酯 0.4ml 甲苯 0.2ml2 "还有是不是样品的融解是不是要与洗脱的起使浓度沟通?怎样笃定样品在最好配比的容液中溶呢?" 样品的融解最好与洗脱的起使浓度沟通，但随机（其实是多数情况下），齐办不到。对Sephadex LH20上样样品的要求是 1 样品一定要融解（Sephadex LH20很贵，要保护填料，我看植化的同道对好填料看得齐很重，工作问题，哈哈哈；同期，幸免样品不融解变成的脱尾） 2 融解样品的体积尽可能小（色谱分离表面的基本要求，减小原始谱带宽度） 3 样品的融解最好与洗脱的起使浓度沟通（若样品的融解溶剂比洗脱的起使浓度洗脱身手强，则会东谈主为增多洗脱起使溶剂的洗脱身手；同期若样品的融解溶剂与洗脱的起使溶剂远隔很大，样品可能以为融解性的问题而析出。） 以上三点是上样的基本要求，随机很难求全，只好证据具体的内容来决定了。一般我的作念法是得志1，2点，尽量得志第三点，“如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）融解”，请防卫我的答复“尽可能”，3 "还有分到什么进度是用Sephadex LH20比较好?" 如果推行室Sephadex LH20很至极，分谈较纯再用， 如果推行室Sephadex LH20很普及，只消得志使用的防卫事项，较粗的样品可径直使用Sephadex LH20分离。日本的师兄齐是用Sephadex LH20粗分，东谈主家有钱，是以不在乎。如果硅胶比Sephadex LH20还贵，你一定先用Sephadex LH20粗分，再用硅胶吧。有好多问题根蒂不是学术自己的问题，东谈主也不可能在真空中搞科研。哈哈，跑题了。超过感谢yxssmaster ，受益良多。我还有一个问题，那上样体积与柱体积最小的比是几许？我用100克的填料，如果样品不好溶，那一次最多能上几许毫升的样呢？解答如下: 1 在分离历程中遭受要分离的样品量很大，而柱层填料相对较少的情况是好多的.一般处分的道路有两条: 1） 将样品一次全上柱，这样分离成果一定不会好，但咱们的侧略是将样品交叠的部分再上一遍或几遍，这叫反复xxxx柱层，平正是责任量小（对比底下就知谈了），在前后较纯的馏分，如果计议组重量饱胀，可就乐去吧。 2 ） 将样品分几次离别分离，这样每次分离的成果一定比将样品一次全上柱的分离成果好，但这样有一个很大的弊病，即是每次柱层的条款不可能保抓完全一至，这样几次柱层分离的馏分间的重现性就存在很大问题，再将几个分开上的柱层馏分合并的历程中，合的太粗，就如同 将样品一次全上柱的合并罢了，仅仅责任量增大了。如果心中不甘，你中有我我中有你的馏分，我也不知怎样合并了。 是以保举的作念法是将样品一次全上柱，再通过反复柱层的门径来渐渐莳植分离成果， 唉呀，我嘴苯，不知有莫得说清。2 100g填料已不少了， astra兄的样品如果委果太多，就只好分开上柱了.3 一般Sephadex LH20上样体积具体也莫得明确的章程，在柱床体积的1／10吧。yxssmaster兄的解答让我再次感到了这个家的缓和。因为搞植化是外行，是以随机一些粗心的问题我方仍然不得其解。看过你的帖子后，心理有了点谱，试着用了一次，不外分得成果不是很好，上了有8毫升的样，我用甲醇洗脱，罢了用约一个保留体积就洗收场，东西不仅越分越少，况兼仍然和没上柱之前差未几，很让东谈主困惑，沉闷。astra 兄不要狂躁，推行是一丝一丝作念出来的，刚驱动老是转折的.率先我要说的是Sephadex LH20不是全能的，你的样品不一定适于用它分离，1 "罢了用约一个保留体积就洗收场"，这很宽泛，这亦然Sephadex LH20这种填料的特质:"洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积"，2 "我用甲醇洗脱，况兼仍然和没上柱之前差未几"，讲解你的样品组分之间分子大小远隔不大，是以Sephadex LH20的凝胶过滤作用不起作用了，如果你还用Sephadex LH20分离，那你应该期骗他反相分派的作用，即先用低浓度的甲醇/水，逐渐莳植甲醇比例，临了才用甲醇洗脱.3 "东西不仅越分越少"，东西越分越少是什么道理? 除了特地组分，Sephadex LH20是无死吸附表象的呀!东西越分越少是指上柱前不纯，上柱后计议居品仍然不纯，我嗅觉东西越弄越少。内容在推行历程中，也总惦记会把东西弄没了，又由于我方是外行，总不敢搪塞选用活动，是以分离发达超过慢，能指破迷团么？谈一些个东谈主念念法样品经过分离一般而言会产生两种罢了 : 1 计议组分的相对纯度莳植，因为经过分离后各组份离别在不同的馏分富集，天然在富集计议组分的馏分入网划组分的含量要比总样中的含量要高，是以咱们说计议组分得以纯化.2 计议组分的统统量减少，因为不管是什么分离妙技，物资的分离总会有交叉，意即不但计议组分漫衍于主要富集计议组分的馏分中，相邻馏分中也定会有它的脚迹，仅仅可能不是相邻馏分的主因素，从分离的角度，那些相邻馏分并非是咱们念念要的，咱们只将计议组分的相对含量高的馏分用于下一步分离，这种罢了势必是与原样比拟用于下一步分离的馏分入网划组分的统统量要少一些.astra兄说"是指上柱前不纯，上柱后计议居品仍然不纯"，我念念其相对纯度是不是有所莳植呢?astra兄说"我嗅觉东西越弄越少"，是不是可以阐述了呢?天然，咱们但愿的是得手的分离应该是"计议组分的相对纯度最大限定的莳植，最大限定的幸免计议组分统统量的减少"老是获得yxssmaster真诚的赐教，超过感谢。我试着用极少的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比较难处理，有莫得好的办法呢？1 astra君提到用极少的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比较难处理，是指甲醇水难蒸干吗?其实这根蒂不应成为问题.astra君请念念一念念，作念植化的，哪有遇不到甲醇水的时候， ODS柱层用甲醇水洗脱， Sephadex LH20柱层用甲醇水洗脱，D101用酒精水洗脱， HP20 用甲醇水洗脱， 高效液相最常用的是反相， 流动相依然甲醇水，可见甲醇水是植化同道最亲密的一又友! 是以蒸不干也要蒸，念念念念办法吗!2 .像水这种高沸点的溶剂是很难蒸干的，，办法是有的，先望望旋转薄膜的几个要素: 真空度， 冷凝液， 挥发温度.1) 真空度决定于水泵的着力和系统的密闭性.一般的国产水泵就能得志日常的需要(包括蒸水)，但一定防卫的是水泵的轮回水一定要开，如果不开轮回水，水泵中的水很快就会变得很热，将极地面减少水泵的着力，且会将抽出的溶剂挥散出来，很不好! 比国产水泵更好的是入涎水泵，比入涎水泵更好的是隔阂泵，系统的密闭性就更紧要了，特地是蒸像水，丁醇这样的溶剂，对系统的密闭性的要求很高，对于系统密闭性不好时，可接纳渐渐拆分法来查漏，最容易出问题的场合在垫圈，国产的旋转薄膜配的垫圈很烂，全不耐氯仿等有机溶剂，当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂，垫圈就废了.是以要多蓄意几个垫圈.2) 冷凝液一般使用水，如果配一台冷阱，使用半量的水配比上办量的汽车冷冻液， 成果棒极了3) 莳植挥发温度天然可以莳植挥发的着力，但可能发生物资的变化，国产旋转薄膜，水泵，用水冷，天然就只好莳植挥发温度了我用东京理化的旋转薄膜，1/2汽车冷冻液冷凝，隔阂泵，蒸水不到45度，很爽!3 向要蒸的水溶液中加甲醇，使甲醇占到30%，蒸出速率将大大莳植!听君一席话，总嗅觉胜读十年书啊！但咱们这里搞植化很莱，仅有几台国产的旋转挥发仪，提及来即憨涩又无奈看你们计划，也能长好多常识，好场合呀在讨教yxssmaster真诚，一朝Sephadex LH20柱子被恶浊了，有什么办法来处理么？1 Sephadex LH20柱子被恶浊了，大多数情况下是由于样品没滤， 将柱头堵住，或由于样品的死吸附(一般很少发生)，使柱子的柱头部分玷辱，一般的处理是将被玷辱的柱头部分的填料弃去，具体作念法很粗心，只将被玷辱的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起，倒掉即可，2 如果柱子整个这个词被玷辱，如果是将Sephadex LH20用反相被玷辱，办法如下规律用水，NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被玷辱的柱子。因为是整个这个词柱子被玷辱，是以玷辱物一定不会完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，玷辱物一定会只在柱头部分），是以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH ，30g NaCl， 1000ml水对于流速曩昔，我的师兄告诉：速率越慢越好，内容应用中发现也不果然，概况范畴在 滴/s 就可以了，随机上一次柱子信赖不可完全分开，多上几次就行了，yxssmaster wrote:Sephadex LH20使全心得谈：4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的采纳。如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）融解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！如若把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很肉痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇融解，过滤后，湿法上样。请问yxssmaster，就用一般的滤纸滤吗？我在推行顶用一般的滤纸，即可. 或用过滤上液相样品的滤膜.再问一下，除菌用的滤膜（0.22微米）不知行不？其实用一般的滤纸即可，除菌用的滤膜（0.22微米）我念念可以，过滤上液相样品的滤膜是0.45微米的.我的样品是用滤膜（0.22微米）过滤的，洗脱剂也用滤膜过滤了，不知为什么，每次上完样，依然有小小的黄色的颗粒物附着在柱子上？不知谈用反响柱分聚散用LH-20阿谁成果比较好.同期如果用统一根LH-20的话，洗脱剂可以从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗?还有一个问题，上LH-20的时候可以用一个梯度洗脱吧?临了用甲醇冲柱就可以了吧??看了上头战友们的计划，嗅觉受益菲浅。小弟也来弄斧班门，发言不合之处，请诸君兄台指正： Sephadex G型葡聚糖凝胶只适应在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后即是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂构成的溶剂中还有反相层析成果。天然价位很高，但由性能颇佳，可再生期骗，是以倍受钦睐。此外上柱样品死亡很少，对处理小样品较好，这亦然咱们推行室常用的原因之一。 我用Sephadex LH-20的体式是： 1.采纳条款： 梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么紧要。率先你的样品须要能融解在尽量极少的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。咱们推行室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了好多年，成果较好。 2.饱和层析柱： 用洗脱剂将凝胶摇匀，赠给柱身，让其天然千里降，此时要注意气泡留在其中。至少半小时洞开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，主义是使其延伸在正确比例的洗脱剂中。 3.样品处理：用尽量少的洗脱剂融解样品，常压过滤。 4.湿法上柱。这亦然要随机间的体式。 5.洗脱：范畴流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更动极性（好多时一个极性就可以将样品洗脱已毕）。 6.再生以备下次使用。率先谢谢yxssmaster 战友的如许多的孝敬偶也用过一阵SEPHADEX柱，把我方的心得讲讲，但愿给全球有用1。其实咱们用的每种用来分离的填料齐有它的比较适应的化合物类别，对于这一丝，但愿能获得yxssmaster 战友的开拓我的植化实战指示未几，然而就我个东谈主以为的：也许SEPHADEX不是很适应分离皂甙类的化合物，因为偶的皂甙上去接了30多瓶，临了算是合并成了一瓶，嗅觉巨失败2。用含水的溶剂来动作流动相，很难挥干，如果放的时候长了还会长霉偶以为比较好的办法是径直拿去冻干，然后再融解走TLC什么的；条款好的话可以走液相来判断流份了goophy wrote:不知谈用反响柱分聚散用LH-20阿谁成果比较好.同期如果用统一根LH-20的话，洗脱剂可以从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗?还有一个问题，上LH-20的时候可以用一个梯度洗脱吧?临了用甲醇冲柱就可以了吧??1.Sephadex LH-20主要依然分子筛的作用机理，在非极性溶剂中有一定的反相柱成果。如要分离的物资在反相板上分离成果好，那么大可在反相柱中进行分离;如果要分离的物资分子量收支较大，天然是Sephadex LH-20成果好。内容使用中时时上在一齐相助使用，逐渐细分为多个部分直到拿到纯品。2.Sephadex使用时一般不进行梯度洗脱（洗柱的时候天然要换）。如果改变流动相的极性，会改变凝胶的延伸率，重量不同的物资在网孔改变历程中引起交错，反而够不上分离成果。如果要分离的样品中极性收支较大，可以细分为不同的极性段再上Sephadex LH-203.临了柱的再生可参见前边战友的跟贴用MeOH作冲柱，有些样品在洗脱时下不来，吸附太强，怎样才能把那些吸附很强的物资洗下来呢？其实，分离同种化合物，在sephadex LH-20上用不同的溶剂也有不同的成果，比如说用甲醇和用丙酮作念流动相，罢了可能就不不异。我作过的某些黄酮的分离以及倍半萜的分离即是用这种门径，成果很好！也试一下？不外黄酮中sephadex LH-20的溶胀悉数很小的！baobo wrote:用MeOH作冲柱，有些样品在洗脱时下不来，吸附太强，怎样才能把那些吸附很强的物资洗下来呢？我的一丝指示，用甲醇安靖冲，5~6s一滴，冲时候长一丝，2－3天，一般会将吸附的样品冲下来，此法适用于多种柱子，正相、反相，HPLC柱，我前两天在上减压正相柱时，样品有不少吸附，加了甲醇，让它一滴一滴往下掉，300ml，已将柱子冲得很干净了，但愿对你有所匡助。goophy wrote:不知谈用反响柱分聚散用LH-20阿谁成果比较好.同期如果用统一根LH-20的话，洗脱剂可以从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗?还有一个问题，上LH-20的时候可以用一个梯度洗脱吧?临了用甲醇冲柱就可以了吧??我以为反相柱和Sephadex其实莫得可比性，反相柱一般用来分离极性较大的因素，象皂苷类化合物.Sephedax LH-20按分子量大小来分，一般消失素成果较好，采纳何种洗脱剂，主要在于在那种溶剂中融解度较好，莫得必要梯度洗.统一个柱子上样前可以从氯仿-甲醇(1:1)到甲醇，但不可换到纯氯仿，因为材料在氯仿中的延伸悉数大会从柱子冒出.我的一丝倡导，接待全球指正.jinmei wrote:我以为反相柱和Sephadex其实莫得可比性，反相柱一般用来分离极性较大的因素，象皂苷类化合物.Sephedax LH-20按分子量大小来分，一般消失素成果较好，采纳何种洗脱剂，主要在于在那种溶剂中融解度较好，莫得必要梯度洗.统一个柱子上样前可以从氯仿-甲醇(1:1)到甲醇，但不可换到纯氯仿，因为材料在氯仿中的延伸悉数大会从柱子冒出.我的一丝倡导，接待全球指正.可以，氯仿比要害会将LH-20浮起来，且LH-20在氯仿中不溶涨.孙小好意思 wrote:yxssmaster wrote:Sephadex LH20使全心得谈：4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的采纳。如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）融解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！如若把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很肉痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇融解，过滤后，湿法上样。请问yxssmaster，就用一般的滤纸滤吗？用滤纸样品死亡大，用一小滴管，塞极少脱脂棉过滤险些不死亡！我用LH-20的体会是可选的溶剂好多，不仅仅氯仿甲醇水，环己烷-氯仿-甲醇，丙酮-甲醇，二氯甲烷-甲醇等等，要津是看样品的在没个系统中的融解性和LH-20在不同溶剂中的溶涨度。空姐大乱交